Quantificacao Da Fixacao Biologica De Nitrogenio Associada A Cultura Da Cana De Acucar Saccharum Officinarum L

Author : L. G. da SILVA
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Download or read book Estudos de colonização em cana-de-açúcar (Saccharum spp.) por Gluconacetobacter diazotrphicus e Herbaspirillum spp. utilizando técnicas imunológicas written by L. G. da SILVA and published by . This book was released on 1999 with total page pages. Available in PDF, EPUB and Kindle. Book excerpt: A cultura da cana-de-açúcar apresenta grande importância na economia mundial e possui papel de destaque durante a história de desenvolvimento de diversos países. No Brasil esta cultura foi responsável pelo surgimento de muitas cidades e, nos dias de hoje, responde por parte importante do agro-negócio nacional, com destaque para o setor energético. Sendo assim, o estudo de organismos fixadores de nitrogênio associados a esta cultura possui destacada importância científica e econômica. Dentre as estratégias tradicionais, que visam a identificação e a quantificação de bactérias diazotróficas, a que tem sido mais utilizada baseia-se no crescimento das mesmas em meio de cultura. Com a utilização destas técnicas a estimativa da população microbiana é limitada por procedimentos de separação das bactérias do material vegetal, o grau de seletividade do meio de cultura utilizado e, também, pela existência de um estado fisiológico conhecido como viável, mas não culturável. Como alternativa a estes métodos têm sido utilizados métodos imunológicos que utilizam como ferramenta moléculas de anticorpos policlonais. Estes anticorpos podem ser utilizados em muitos diferentes tipos de imuno-ensaios como, por exemplo, o Método ELISA (Enzyrne Linked Immunosorbent Assay) que permite a detecção de antígenos em meio líquido, como é o caso dos extratos vegetais. Neste trabalho foram produzidos anti-soros e anticorpos policlonais contra as bactérias diazotróficas Cluconacetobacter diazotrophicus (PR2 e PAL3) e Herbaspirillum seropedicae (Z67 e HRC54). Estes foram caracterizados, juntamente a dois outros soros policlonais, anteriormente produzidos contra H. rubrisubalbicans (HCClO3 e M4). Todas as curvas de diluição obtidas permitiram que fossem utilizadas diluições dos mesmos com concentrações de imunoglobulinas que satisfizeram a todos os ensaios realizados. Todos apresentaram valores de nível mínimo de detecção dentro da faixa de sensibilidade requerida pelo Método ELISA Indireto. Após a etapa de purificação (coluna de ptn A) apresentaram concentrações de imunoglobulinas dentro do estipulado pela bibliografia e com grau de especificidade satisfatório. Após a etapa de produção e caracterização dos anti-soros e anticorpos partiu-se para a utilização dos mesmos na quantificação das populações das referidas bactérias em extratos vegetais de cana-de-açúcar. Nos dois experimentos iniciais, nos quais utilizamos o Método ELISA Indireto, obteve-se um alto "background" na presença do soro pré-imune, quando o mesmo foi ensaiado contra extratos vegetais de cana-de-açúcar. Várias soluções extratoras foram utilizadas, porém, uma redução efetiva do "background" só foi conseguida quando se utilizou paraformaldeído para a inativação da atividade endógena das enzimas presentes no material vegetal. A utilização deste novo protocolo, juntamente com os antissoros e anticorpos policlonais utilizados se mostraram eficientes na quantificação das populações de Herbaspirillum seropedicae, H. rubrisubalbicans e C. diazotrophicus em cana-de-açúcar. Não foi possível, porém, traçar um padrão de comportamento destas populações em função da variedade, espécie e/ou parte da cana-de-açúcar estudada. Em função dos nossos dados, podemos afirmar que o Método ELISA Indireto com as alterações introduzidas neste trabalho apresenta melhor desempenho que o método tradicional de quantificação de microrganismos através do crescimento dos mesmos em meios de cultura e contagem pelo Método do Número Mais Provável. Sugar cane is a crop of great importance in the world economy. This crop has been of great economic importance in diverse countries during the course of their history .In Brazil, the sugar cane was responsible for the rise of many cities and still today it answers for a very significant part of the national agro-business, with prominence for the energy sector. Therefore, the study ofthe N2-fixing organisms associated with this crop has great scientific importance. Amongst the traditional strategies to identify and quantify these diazotrophic bacteria, the one that has been most used is based on their growth in culture media. With these techniques the estimate of the microbial population is limited by the procedures of recovery , the degree of selectivity of the culture medium employed, and also by the existence of a physiological state known as viable, but not culturable. As an altemative to these methods, immunological methods can be utilised that use as a tool molecules of polyclonal antibodies. These antibodies can be used in many different types of immuno-assays, amongst them the ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) method that allows the antigen detention in liquid medium, which is suitable in the case of plant extracts. In this work polyclonal antisera and antibodies against the diazotrophic bacteria Gluconacetobacter (strains PR2 and P AL3) and Herbaspirillum seropedicae (strains Z67 and HRC54) were produced. These were characterised, using two polyclonal antisera previously produced against H. nlbrisubalbicans (strains HCC 103 and M4). All the dilution curves of the sera obtained showed that they contained concentrations of immunoglobulins that were sufficiently high to perform all of the assays. All presented values of the minimum level of detention and sensitivity required for the indirect ELISA method. After the stage of purification (protein A colurnn) the concentrations of immunoglobulins were within the range stipulated in the literature and showed a satisfactory degree of specificity .After the antisera and antibodies were fully characterised these were used in the quantification of the populations of the aforementioned diazotrophic bacteria in plant extracts of sugar cane. In the two initial experiments, using the indirect ELISA Method, a high background absorbance was experienced in the presence of the pre-immune serum, when this technique was applied to extracts of sugar cane. A reduction in the background absorbance was only obtained when formaldehyde was used for the inactivation of the endogenous activity of enzymes in the plant material. The use of this protocol, and polyclonal anti-sera and antibodies were shown to be efficient in the quantification ofthe populations ofthe Herbaspirillum seropedicae, H. rubrisubalbicans and G. diazotrophicus in sugar cane plants. The polyclonal anti-sera and antibodies, produced and characterised as described Chapter I, were shown to be efficient when used for the indirect ELISA method for the quantification of the specific species. A standard behaviour of the bacterial populations studied in function of the variety, species and/ or part of the studied sugar cane was not found. As a result of this study it was show that the indirect ELISA method, with the modifications introduced in this work, is a considerable improvement on the traditional.