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Etude De La Proteine Partiellement Desordonnee Engrailed 2 Par Rmn Et Nouvelles Methodes Pour La Mesure De Coefficients De Diffusion Et Lattribution Des Signaux Des Chaines Laterales De Proteine
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Book Synopsis Etude de la Protéine Partiellement Désordonnée Engrailed 2 Par RMN Et Nouvelles Méthodes Pour la Mesure de Coefficients de Diffusion Et L'attribution Des Signaux Des Chaines Latérales de Protéine by : Rafal Augustyniak
Download or read book Etude de la Protéine Partiellement Désordonnée Engrailed 2 Par RMN Et Nouvelles Méthodes Pour la Mesure de Coefficients de Diffusion Et L'attribution Des Signaux Des Chaines Latérales de Protéine written by Rafal Augustyniak and published by . This book was released on 2011 with total page 141 pages. Available in PDF, EPUB and Kindle. Book excerpt: Dans cette thèse, nous présentons les applications de techniques de la RMN bien établies ainsi que le développement de nouvelles méthodes. Tout d'abord, nous étudions un fragment de l'homéoprotéine Engrailed 2 qui comprend un domaine globulaire, l'homéodomaine, et son extension N-terminale intrinsèquement désordonnée. Après avoir présenté le protocole d'expression et de purification de la protéine recombinante, l'attribution des signaux RMN est présentée en détail. Les déplacements chimiques ont fourni des informations sur le repliement partiel des régions en dehors de l'homéodomaine. Les mesures des vitesses de relaxation de l'azote 15 nous ont permis d'identifier des fragments ayant une mobilité restreinte, qui comprennent des sites d'interaction protéine-protéine et de phosphorylation d'Engrailed 2. Les interactions à longue distance entre l'homéodomaine et son extension N-terminale ont été caractérisées par l'insertion d'une sonde paramagnétique sur le résidu Cys175. Dans la partie méthodologique de ce travail, nous avons proposé de nouvelles expériences pour mesurer les coefficients de diffusion translationnelle de biomolécules. Ces expériences rapides et plus sensibles peuvent être utilisées, entre autres, pour contrôler la stabilité d'échantillons RMN de protéines, ce qui a été démontré sur Engrailed. Enfin, nous avons développé une stratégie pour effectuer l'attribution stéréospécifique des protons méthylènes dans des protéines partiellement deutérées à partir de nouvelles expériences NOESY. L'impact de cette attribution sur la qualité des structures 3D obtenues à partir de nos données est illustré sur la calbindine D9k.
Book Synopsis Etude du repliement des protéines par RMN temps réel et autres méthodes biophysiques by : Thomas Cutuil
Download or read book Etude du repliement des protéines par RMN temps réel et autres méthodes biophysiques written by Thomas Cutuil and published by . This book was released on 2012 with total page 0 pages. Available in PDF, EPUB and Kindle. Book excerpt: La Beta-2-microglobuline est une protéine de 12kDa, impliquée dans une maladie dûe à un mauvais repliement: l'amylose liée à la dialyse. Elle constitue donc un modèle pour la formation de fibrilles amyloides et pour le repliement des protéines. La B2M est un objet à la fois difficile et fructueux à étudier. La production de B2M est complexe et demande une optimisation important pour obtenir une protéine correctement repliée et atteindre des rendements approprié pour des études de RMN et SAXS. Le repliement de la B2M est sensible au solvent, à la température, à la concentration et souvent aux conditions de préparation. Pourtant notre étude, à l'aide de plusieurs méthodes biophysiques, a pu révéler plusieurs faits essentiels de son mécanisme de repliement et de la structure et propriétés des intermédiaires. Un premier résultat est que le repliement et l'oligomérisation sont deux processus concourants. Une découverte majeure est l'existence d'un équilibre monomère oligomère entre deux états I1 et I2 intermédiaires du repliement. Détecté indirectement à l'aide de RMN temps réel comme SOFAST, I2 a été directement charactérisé en SAXS: Il s'agit probablement d'un dimère. Les états intermédiaires de repliement de B2M avaient été pointés comme favorisant la formation de fibrilles: cela s'explique facilement avec l'existence d'un intermédiaire dimérique. Une combinaison de méthodes biophysiques permet la caractérisation de cet équilibre monomère-oligomère. En SAXS, puis confirmé en RMN, la stoichiométrie de l'équilibre est celle d'un monomère-dimère. Des travaux complémentaires utilisant les techniques développées pour cette étude pourront servir à caractériser plus finement cet équilibre. L'étude approfondie du repliement de B2M pousse les techniques biophysiques dans leurs retranchements: la sensibilité et le temps d'acquisition pour la RMN, la polydispersité pour le SAXS. Pourtant dans les deux cas un grand oligomère I3, qui disparait en quelques minutes, a pu être détecté, ce qui fut confirmé par UV-Fluo. La caractérisation d'I3 demandera des dévelopements méthodologiques supplémentaires, ainsi qu'un nouveau plan d'expérience. D'autres méthodes comme la spectrométrie de masse nano-ESI pourraient représenter des sources d'information utiles. S'attaquer aux limites des méthodes biophysiques pousse au développement méthodologique. Ainsi pour étudier la structure et dynamique d'I1, la méthode d'acquisition continue des données a permis l'attribution des résonnances de cette espèce qui a une demi vie de quelques dizaines de minutes. Un échange conformationnel a été découvert pour l'état I1 du mutant W60G, en développant une méthode de relaxation RMN: R2-BEST-TROSY. Les méthodes développées pour cette étude pourront servir des études sur le repliement d'autres protéines, mais aussi dans d'autres contextes où la demi-vie des objets étudiés est courte, comme dans les expérience RMN intracellulaires. Cette étude est évidemment éloignée d'une application directe dans le combat contre les maladies du mauvais repliement des protéines. Pour autant, la découverte d'états intermédiaires oligomériques souligne que l'oligomérisation et le repliement ne devraient pas être étudiés séparément, mais sont des processus liés. Les développements méthodologiques de cette étude pourront aussi être appliqués à d'autres protéines comme à d'autres contexte. Il est donc permis d'espérer que ces questionnements et développements permettront d'avancer vers une meilleure compréhension de ces maladies.
