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Apports De Lechange Hydrogene Deuterium Couple A La Spectrometrie De Masse En Proteomique Structurale Pour La Caracterisation De Complexes Multi Proteiques
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Book Synopsis Apports de l'échange hydrogène/deutérium couplé à la spectrométrie de masse en protéomique structurale pour la caractérisation de complexes multi-protéiques by : Guillaume Terral
Download or read book Apports de l'échange hydrogène/deutérium couplé à la spectrométrie de masse en protéomique structurale pour la caractérisation de complexes multi-protéiques written by Guillaume Terral and published by . This book was released on 2016 with total page 0 pages. Available in PDF, EPUB and Kindle. Book excerpt: Ce travail de thèse porte sur développement de méthodes en spectrométrie de masse structurale pour l'analyse de protéines recombinantes et de leurs complexes associés. L'objectif central s'est porté sur des développements méthodologiques en échange hydrogène/deutérium couplé à la spectrométrie de masse (HDX-MS). Les techniques biophysiques de caractérisation structurale à haute résolution comme la cristallographie ou la RMN se heurtent régulièrement à des problèmes de productions de cristaux, de taille de complexes analysables ou encore de quantité de matériel nécessaire importante. Le développement de méthodes spécifiques HDX-MS a permis de réaliser une caractérisation structurale de systèmes protéiques variés, et réfractaires aux approches haute résolution. La combinaison de cette approche à différents outils de MS structurale est aussi illustrée, et montre tout son intérêt pour l'obtention d'informations à résolution augmentée.
Book Synopsis Développement de nouvelles méthodologies par spectrométrie de masse à très haute résolution pour l'analyse structurale de complexes protéiques by : Ophélie Robine
Download or read book Développement de nouvelles méthodologies par spectrométrie de masse à très haute résolution pour l'analyse structurale de complexes protéiques written by Ophélie Robine and published by . This book was released on 2012 with total page 236 pages. Available in PDF, EPUB and Kindle. Book excerpt: L'association échanges hydrogène/deutérium et spectrométrie de masse (HDX/MS) est devenue un outil analytique de choix pour l'étude de la structure et dynamique des protéines. L'approche classique "bottom-up" repose sur la digestion à la pepsine de la protéine deutérée et analyse des peptides protéolytiques par MS. Malheureusement, cette approche souffre de deux limitations majeures : (1) la résolution limitée par la taille des peptides après digestion et (2) l'échange inverse en solution avant l'analyse par MS. La MS en tandem classique ne peut pas être utilisée pour améliorer la résolution depuis que des expériences CID (Collision Induced Dissociation) sur des peptides deutérés ont montré une migration intramoléculaire des deutériums avant dissociation ("scrambling"). Par conséquent, il y a un grand intérêt à développer des approches HDX/MS alternatives pour améliorer les problèmes d'échange inverse, scrambling et résolution. Ce travail a donc consisté à mettre au point une méthode top-down HDX/MS robuste. Un nouveau système d'introduction des protéines deutérées dans le spectromètre de masse, appelé "cryosource", a été développé et les techniques d'activation basées sur la capture/transfert d'électron ont été utilisées. Il a récemment été montré que les méthodes ECD/ETD réduisaient le scrambling dans des conditions contrôlées avec une résolution à l'acide aminé près. L'utilisation de la cryosource a permis de diminuer l'échange inverse pendant des temps longs et avec des débits faibles. L'optimisation de tous les paramètres a été réalisée sur des peptides/protéine modèles. Notre objectif final était que notre approche soit applicable à l'analyse structurale du complexe aIF2
Book Synopsis Caractérisation structurale de protéines membranaires par échange hydrogène/deutérium spectrométrie de masse by : Shahid Mehmood
Download or read book Caractérisation structurale de protéines membranaires par échange hydrogène/deutérium spectrométrie de masse written by Shahid Mehmood and published by . This book was released on 2012 with total page 0 pages. Available in PDF, EPUB and Kindle. Book excerpt: Des exporteurs « ATP-Binding Cassette » (ABC) sont connus pour être responsables de la résistance contre un large spectre d'agents antibiotiques ou chimiothérapeutiques chez les bactéries et les cellules de mammifères. L'échange hydrogène / deutérium associé à la spectrométrie de masse (HDX-MS) a été utilisé pour caractériser les changements conformationnels de deux exporteurs ABC bactériens, BmrA et BmrC/BmrD, en présence et en absence de nucléotide. Les cinétiques locales d'HDX ont montré la nature hautement dynamique des domaines intra-cellulaires (ICDs) dans la forme apo, ce qui n'était pas attendu d'après les structures cristallographiques aux rayons X des protéines homologues. Dans la conformation ouverte vers l'extérieur (« outward facing »), domaines fixant les nucléotides (NBDs) interagissant, le mouvement des ICDs sont largement réduits pour les deux transporteurs. Les cinétiques d'HDX MS dans la conformation « outward facing » ont été déterminées en appliquant cette technique sur des mutants incapables d'hydrolyser les nucléotides et sur la forme sauvage inhibée au vanadate. La dynamique des NBDs, en particulier pour les régions qui interagissent au cours de l'hydrolyse de l'ATP, a été aussi diminuée dans la conformation « outward facing » comparativement à celle ouverte vers l'intérieur. L'ajout de différents agents connus pour être transportés par des transporteurs ABC n'a pas affecté la dynamique des NBDs. Par ailleurs, nous avons aussi appliqué l'HDX MS à la protéine GLIC, un homologue procaryote d'un « ligand-gated ion channel » pentamérique (pLGIC). Les cinétiques locales d'HDX sont en plein accord avec la structure cristallographique disponible et le changement de pH révèle des différences de deutération dans les régions d'interaction des sous-unités.
Book Synopsis Etudes structurales des protéines par spectrométrie de masse couplée aux échanges hydrogène/deuterium et à la réticulation chimique by : Laëtitia Cravello
Download or read book Etudes structurales des protéines par spectrométrie de masse couplée aux échanges hydrogène/deuterium et à la réticulation chimique written by Laëtitia Cravello and published by . This book was released on 2005 with total page 184 pages. Available in PDF, EPUB and Kindle. Book excerpt: Les protéines sont impliquées dans de nombreux processus biologiques. Il est nécessaire pour comprendre en détail leur fonction et leur mode d’action afin d’obtenir des informations sur leur structure et sur leurs interactions éventuelles avec leurs partenaires. Le travail réalisé durant cette thèse a consisté à développer deux méthodes innovantes utilisant la spectrométrie de masse pour étudier la structure des protéines et à appliquer ces méthodes à une problématique biologique. Nous avons optimisé une méthode associant les échanges H/D et la spectrométrie de masse sur une protéine modèle, la protéine PBP-2X. L’utilisation combinée de trois protéases nous a permis d’obtenir un meilleur recouvrement de séquence de la protéine étudiée et une plus grande résolution spatiale dans la localisation des zones d’intérêt. Une méthode associant la réticulation chimique et la spectrométrie de masse a été mise au point sur une protéine modèle : le cytochrome c. Les contraintes de distances ainsi obtenues vont intervenir dans une démarche bioinformatique visant à déterminer la famille de repliement d’une protéine de structure inconnue. Enfin, ces deux méthodes ont été appliquées avec succès sur des protéines du système de sécrétion de type III de Pseudomonas aeruginosa : PcrV et PcrG. Nos résultats expérimentaux sur PcrV corrèlent à la structure modélisée de PcrV et la protéine PcrG est globalement peu structurée. L’interaction PcrV-PcrG a été caractérisée, elle met en jeu les domaines « coiled-coil » de chacune des deux protéines. La formation du complexe induit un changement de la conformation de PcrV qui pourrait avoir pour conséquence la stabilisation de PcrG.
Book Synopsis L' échange isotopique hydrogène/deutérium et la spéctrométrie de masse pour l'étude d'interactions protéine-protéine by : Alexis Nazabal
Download or read book L' échange isotopique hydrogène/deutérium et la spéctrométrie de masse pour l'étude d'interactions protéine-protéine written by Alexis Nazabal and published by . This book was released on 2003 with total page 42 pages. Available in PDF, EPUB and Kindle. Book excerpt: Le travail de thèse est consacré au développement et à l'application d'une méthodologie qui permet d'obtenir par spectrométrie de masse des informations sur la façon dont les sous unités d'un complexe protéique sont agencée ainsi que sur la conformation adopté par les sous-unités. La méthodologie utilisée est basée sur le remplacement des hydrogène amides mobiles des liaisons peptidiques lors de la mise en présence séquentielle des protéines dans de l'eau lourde et de l'eau légère. Le temps qu'il faut pour réaliser ces échanges varie avec l'accessibilité des hydrogènes et leur engagement plus ou moins poussé dans les liaison hydrogènes. Pour mesurer ces temps nécessaire à l'échange en divers points de la protéine, il faut soumettre celle-ci à une digestion enzymatique qui génère des peptides dont la masse moléculaire est mesurée dans des expériences de couplage chromatographie-spectrométrie de masse (LC-MS). On différentie ainsi les zones de la protéine en terme d'accessibilité différentes et de structure 3D différentes. Le manuscrit présente ensuite un travail de mise au point de la méthodologie sur la sous-unité e du complexe F1 ATPase de Saccharomyces Cerevisiae. Les interactions de la sous unité e ont été étudiées. Cette partie à permis de mettre au point une méthode de micro-chromatographie ZIPTIP qui nécessite des quantités de matériel très réduite par rapport aux méthodes décrites dans la littérature. Cette partie à donc permis d'évaluer la pertinence de l'approche pour l'étude des interactions au sein d'un complexe hétéro-oligomérique par échange H/D. La méthodologie a ensuite été utilisé pour l'étude structurale de la protéine prion HET-s de Podospora Anserina. L'étude par LC-MS à nano-débit à permis de déterminer les taux d'échange pour 87% de la séquence peptidique. L'interprétation des résultat montre une forte diminution de l'incorporation de deutérium dans la partie C-terminale de la protéine lorsque celle-ci est agrégée en fibre amyloïdes ce qui suggère que la partie 240-295 de la protéine HET-s est fortement impliquées dans les interactions au sein de la fibre amyloïde.
Book Synopsis Etudes structurales des protéines par spectrométrie de masse couplée aux échanges hydrogène/deuterium et à la réticulation chimique by : Laëtitia Cravello
Download or read book Etudes structurales des protéines par spectrométrie de masse couplée aux échanges hydrogène/deuterium et à la réticulation chimique written by Laëtitia Cravello and published by . This book was released on 2005 with total page 0 pages. Available in PDF, EPUB and Kindle. Book excerpt: Les protéines sont impliquées dans de nombreux processus biologiques. Il est nécessaire pour comprendre en détail leur fonction et leur mode d'action afin d'obtenir des informations sur leur structure et sur leurs interactions éventuelles avec leurs partenaires. Le travail réalisé durant cette thèse a consisté à développer deux méthodes innovantes utilisant la spectrométrie de masse pour étudier la structure des protéines et à appliquer ces méthodes à une problématique biologique. Nous avons optimisé une méthode associant les échanges H/D et la spectrométrie de masse sur une protéine modèle, la protéine PBP-2X. L'utilisation combinée de trois protéases nous a permis d'obtenir un meilleur recouvrement de séquence de la protéine étudiée et une plus grande résolution spatiale dans la localisation des zones d'intérêt. Une méthode associant la réticulation chimique et la spectrométrie de masse a été mise au point sur une protéine modèle : le cytochrome c. Les contraintes de distances ainsi obtenues vont intervenir dans une démarche bioinformatique visant à déterminer la famille de repliement d'une protéine de structure inconnue. Enfin, ces deux méthodes ont été appliquées avec succès sur des protéines du système de sécrétion de type III de Pseudomonas aeruginosa : PcrV et PcrG. Nos résultats expérimentaux sur PcrV corrèlent à la structure modélisée de PcrV et la protéine PcrG est globalement peu structurée. L'interaction PcrV-PcrG a été caractérisée, elle met en jeu les domaines « coiled-coil » de chacune des deux protéines. La formation du complexe induit un changement de la conformation de PcrV qui pourrait avoir pour conséquence la stabilisation de PcrG.
Book Synopsis Apport de la spectrométrie de masse à l'élucidation de mécanismes biologiques by : Ana Paula Moraes Ventura
Download or read book Apport de la spectrométrie de masse à l'élucidation de mécanismes biologiques written by Ana Paula Moraes Ventura and published by . This book was released on 2005 with total page 552 pages. Available in PDF, EPUB and Kindle. Book excerpt: Grâce au séquençage des génomes et aux progrès de la spectrométrie de masse, l'analyse protéomique se révèle un outil puissant pour l'identification des protéines. Les techniques telles que l'électrophorèse bidimensionnelle, la spectrométrie de masse et la bioinformatique constituent les clés d'une approche nommée " méthodologie classique de la protéomique ". La recherche en protéomique évolue de plus en plus vers la caractérisation de protéines issues de mélanges complexes, avec pour but de mieux comprendre les systèmes biologiques, les interactions entre protéines, ainsi que leurs fonctions. Deux méthodes d'ionisation sont mises en oeuvre dans le cadre des études de biologie structurale : le MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization) et l'électronébulisation (ESI, Electrospray Ionization). Ces deux techniques possèdent l'avantage d'être suffisamment douces pour ioniser et amener à l'état gazeux des macromolécules biologiques (protéines et des acides amines). La technique protéomique a été mise au point lors de ce travail de thèse, au sein du Laboratoire de Spectrométrie de Masse de l'Institut de Chimie des Substances Naturelles (ICSN, CNRS, Gif-sur-Yvette). Ainsi, plusieurs collaborations ont été engagées, qui font intervenir des compétences pluridisciplinaires. Dans une première partie sera décrite l'étude de complexes purifiés selon le protocole TAP. Cette méthodologie a permis la description de nouvelles sous-unités du snRNP U2, ainsi que l'identification d'un nouveau complexe, RES, impliqué dans le processus d'épissage alternatif. La caractérisation d'un complexe ultime (Dcs1 et Dcs2) de dégradation des ARNm a été réalisée. Dans un deuxième temps, la protéomique différentielle a été mise à profil dans le but de mieux appréhender la pathogenèse de la Mucoviscidose. Un élément fondamental a ainsi été révélé : la sous expression de l'Annexine 1, protéine critique du processus anti-inflammatoire/protecteur, et cruciale pour maintenir l'homéostasie et la réparation des tissus après un épisode inflammatoire. Un autre objectif d'étude a consisté en l'identification d'une nitro-réductase issue d'une souche de Bacillus sp. Cette enzyme s'avère capable de réaliser une double réduction du groupement nitro du 3,5-DNBTF. En fin, le dernier chapitre concerne le traitement par plasma froid à pression atmosphérique d'une protéine modèle : le lysosyme. Cette étude a permis d'identifier une modification chimique spécifique des résidus aminés tryptophane. L'ensemble de ces résultats illustre l'importance, dans des domaines très variés, de la protéomique ciblée.
Book Synopsis ETUDE CONFORMATIONNELLE ET STRUCTURALE DE L'ACETOHYDROXY ACIDE ISOMEROREDUCTASE DE PLANTE PAR ECHANGES HYDROGENE/DEUTERIUM ET SPECTROMETRIE DE MASSE by : FREDERIC.. HALGAND
Download or read book ETUDE CONFORMATIONNELLE ET STRUCTURALE DE L'ACETOHYDROXY ACIDE ISOMEROREDUCTASE DE PLANTE PAR ECHANGES HYDROGENE/DEUTERIUM ET SPECTROMETRIE DE MASSE written by FREDERIC.. HALGAND and published by . This book was released on 1998 with total page 161 pages. Available in PDF, EPUB and Kindle. Book excerpt: LA COMBINAISON DES ECHANGES HYDROGENE/DEUTERIUM AVEC LA SPECTROMETRIE DE MASSE EN MODE D'IONISATION ELECTROSPRAY EST DEVENUE UN OUTIL TRES PRECIEUX POUR L'OBTENTION D'INFORMATIONS CONFORMATIONNELLES ET DYNAMIQUES SUR LES PROTEINES. LA METHODOLOGIE DECRITE PAR ZHANG ET SMITH EN 1993 (ZHANG, Z. & SMITH, D. L. (1993). PROTEIN SCI 2(4), 522-31). POUR LE FAB-MS A ETE ADAPTEE POUR NOTRE ETUDE A L'ESI-MS. MISE AU POINT SUR LE CYTOCHROME C#2 DE RHODOBACTER CAPSULATUS, PUIS TESTE EN ETUDIANT L'INFLUENCE STRUCTURALE DE MUTATIONS, CETTE METHODE D'ETUDE CONFORMATIONNELLE PAR ECHANGES H/D ET ESI-MS A ETE APPLIQUEE A UNE ENZYME DE PLANTE, CIBLE POTENTIELLE D'HERBICIDE, L'ACETOHYDROXY ACIDE ISOMEROREDUCTASE. LE BUT DE NOS ETUDES ETAIT DE CARACTERISER LES CHANGEMENTS CONFORMATIONNELS LIE A LA FIXATION SEQUENTIELLE DES LIGANDS (IONS MG#2#+, NADPH ET UN INHIBITEUR COMPETITIF, LE N-HYDROXY-N-ISOPROPYLOXAMATE, IPOHA). NOUS AVONS AINSI MONTRE QUE LES IONS MG ET LE NADPH PARTICIPAIENT A LA STRUCTURATION DU SITE ACTIF DE L'ENZYME NECESSAIRE A LA FIXATION DU SUBSTRAT ET/OU D'UN INHIBITEUR COMPETITIF. PAR AILLEURS, NOUS AVONS MONTRE QU'IPOHA ETAIT COMPLETEMENT ENFOUI DANS LE SITE ACTIF, RIGIDIFIANT CE DERNIER ET EMPECHANT PAR LA MEME SON RELARGAGE. CECI EXPLIQUE EN PARTIE SON CARACTERE QUASI-IRREVERSIBLE. ENFIN, LE DIMERE DE CETTE ENZYME SEMBLE JOUER UN ROLE IMPORTANT DANS LA DYNAMIQUE DE CETTE ENZYME, NOMBRE DE CHANGEMENTS CONFORMATIONNELS AYANT ETE IDENTIFIES A L'INTERFACE DES DEUX MONOMERES. CES RESULTATS ONT FOURNIS DE PRECIEUX RENSEIGNEMENTS POUVANT EVENTUELLEMENT SERVIR A LA CONCEPTION DE NOUVEAUX HERBICIDES. DANS LE BUT DE MIEUX COMPRENDRE L'ACTION DE CET INHIBITEUR COMPETITIF ET LE COMPORTEMENT DU DIMERE DE L'ISOMEROREDUCTASE, DES MESURES DE MASSE DES COMPLEXES NON-COVALENTS DE L'ISOMEROREDUCTASE AVEC SES DIFFERENTS LIGANDS ONT ETE ENTREPRISES. LES RESULTATS ONT PERMIS DE CONFIRMER QUE LA STOECHIOMETRIE DE FIXATION DES LIGANDS EST EN PARFAIT ACCORD AVEC LES EXPERIENCES DE BIOCHIMIE ET DE CRISTALLOGRAPHIE. L'ISOMEROREDUCTASE ETANT UNE CIBLE HERBICIDE, UN SCREENING HAUTE CAPACITE A ETE PRATIQUE SUR CELLE CI. LA MISE EN EVIDENCE D'UNE NOUVELLE CLASSE D'INHIBITEURS DE LA FAMILLE DES THIADIAZOLES, ACTIFS A DES DOSES DE L'ORDRE DE LA PICOMOLE PAR L SUGGERAIT UN LIEN COVALENT ENTRE L'ENZYME ET L'INHIBITEUR. NOUS AVONS ALORS MONTRE LE CARACTERE COVALENT DE CE LIEN POUR L'UN D'EUX, PUIS CARACTERISE LE MODE D'ACTION ET LE SITE D'INHIBITION DE CE DERNIER.
Book Synopsis ANALYSES STRUCTURALES DE PROTEINES ET DE COMPLEXES DE COORDINATION PAR SPECTROMETRIE DE MASSE by : FRANCIS.. BITSCH
Download or read book ANALYSES STRUCTURALES DE PROTEINES ET DE COMPLEXES DE COORDINATION PAR SPECTROMETRIE DE MASSE written by FRANCIS.. BITSCH and published by . This book was released on 1991 with total page pages. Available in PDF, EPUB and Kindle. Book excerpt: LE BUT DE NOTRE THESE A ETE DE DEVELOPPER DES METHODES ET DE STRATEGIES D'ANALYSES STRUCTURALES DE PEPTIDES, DE PROTEINES ET DE COMPLEXES DE COORDINATION PAR SPECTROMETRIE DE MASSE. L'ETUDE DES MASSIFS ISOTOPIQUES NOUS A PERMIS DE DETERMINER LES CONDITIONS D'UTILISATION DES MESURES DE MASSE MONOISOTOPIQUES ET MOYENNES. NOUS AVONS ETUDIE DANS QUELLES CONDITIONS CES MESURES PERMETTAIENT DE METTRE EN EVIDENCE DES MODIFICATIONS COURAMMENT RENCONTREES SUR DES PROTEINES. L'INTERPRETATION DES FRAGMENTATIONS DES IONS PEPTIDIQUES EN LSIMS NOUS A PERMIS D'OBTENIR DES INFORMATIONS DE SEQUENCE PEPTIDIQUE SUR DES VARIANTS DE L'HIRUDINE RECOMBINANTE AINSI QUE SUR DES PEPTIDES DE COUPURES DE LA PROTAMINE SP DE SEICHE. L'ETUDE DE LA FRAGMENTATIONS DES LIAISONS DISULFURES EN LSIMS NOUS ONT PERMIS DE PROPOSER UNE NOUVELLE STRATEGIE DANS L'ATTRIBUTION DES PONTS DISULFURES; CELLE-CI A ETE APPLIQUEE A LA DETERMINATION DES PONTS DISULFURES DE LA DEFENSINE A NATURELLE ET RECOMBINANTE. NOUS AVONS APPLIQUE L'IONISATION PAR ELECTROSPRAY (ES-MS) A LA CARACTERISATION DE PEPTIDES ET DE PROTEINES INTACTES, NATURELLES OU PRODUITES PAR LA SYNTHESE CHIMIQUE OU LE GENIE GENETIQUE. L'UTILISATION DE LA FAB-MS ET DE L'ES-MS NOUS A PERMIS D'ELUCIDER LES STRUCTURES DE COMPLEXES DE COORDINATION MACROMOLECULAIRES (CARTENATES) POUR LESQUELS LA CARACTERISATION EST DIFFICILE PAR LES METHODES ACTUELLES D'ANALYSE (R.M.N.)
Book Synopsis Advances in mass spectrometry based proteomics by : Guillaume Bechade
Download or read book Advances in mass spectrometry based proteomics written by Guillaume Bechade and published by . This book was released on 2009 with total page 247 pages. Available in PDF, EPUB and Kindle. Book excerpt: L’engouement autour de l’analyse protéomique par spectrométrie de masse a masqué des questions essentielles comme la qualité et la validation des résultats. Des difficultés majeures persistent pour identifier toutes les protéines d’un échantillon et en obtenir un recouvrement de séquence maximal. Actuellement, l’information recueillie est largement incomplète et incertaine. Les progrès à réaliser passent par l’amélioration des techniques séparatives, de la spectrométrie de masse, et des outils bioinformatiques de validation des données protéomiques. Dans ce contexte, ce travail de thèse s’est articulé autour de deux thématiques : ‣ Le développement de méthodologies pour améliorer l’analyse protéomique. Une étude de la répétabilité des analyses nanoLC-MS/MS d’échantillons protéiques complexes a conduit à la mise en place de solutions simples pour améliorer le nombre et la qualité des identifications. Ces innovations ont été appliquées à (1) la recherche de biomarqueurs spécifiques de leucémies au diagnostic ambigu ; (2) l’identification de partenaires d’interaction de facteurs de transcription suppresseurs de tumeur dans le foie. ‣ La mise au point d’approches pour la caractérisation de complexes protéiques covalents à liaison cystéine-cystéine. Des mesures de protéines entières par LC-MS haute résolution et l’analyse par nanoLC-MS/MS de dipeptides ont notamment permis l’étude de mécanismes rédox intracellulaires. Ces travaux, proposant une utilisation plus fine et fiable de la spectrométrie de masse, ont montré de manière univoque la pertinence de l’approche protéomique pour la découverte clinique, l’analyse fonctionnelle et l’étude de mécanismes enzymatiques.
Book Synopsis Nouvelles méthodologies en spectrométrie de masse native et mobilité ionique pour la caractérisation structurale de protéines d'intérêt thérapeutique et de complexes multiprotéiques by : Thomas Botzanowski
Download or read book Nouvelles méthodologies en spectrométrie de masse native et mobilité ionique pour la caractérisation structurale de protéines d'intérêt thérapeutique et de complexes multiprotéiques written by Thomas Botzanowski and published by . This book was released on 2019 with total page 0 pages. Available in PDF, EPUB and Kindle. Book excerpt: Ce travail de thèse repose sur le développement de méthodes en spectrométrie de masse native et mobilité ionique pour la caractérisation structurale de protéines d'intérêt thérapeutique et de complexes multiprotéiques. L'optimisation fine et conséquente de la préparation d'échantillon et des conditions analytiques ont permis la caractérisation de protéines membranaires solubilisées en milieu détergent, protéines hydrophobes habituellement réfractaires à l'analyse par MS. D'autre part, une nouvelle approche de mobilité ionique appelée Collision Induced Unfolding a été évaluée et mise en place au laboratoire. Elle a permis une caractérisation conformationnelle approfondie et originale de plusieurs formats d'anticorps monoclonaux thérapeutiques. Enfin, les techniques de MS native et de mobilité ionique ont été utilisées pour caractériser des complexes multiprotéiques d'hétérogénéité variable mettant ainsi en lumière leurs avantages et les progrès réalisés dans le domaine de la MS structurale.
Book Synopsis Analyse de la diversité structurale des complexes de protéasome humain par approches protéomiques quantitatives by : Bertrand Fabre
Download or read book Analyse de la diversité structurale des complexes de protéasome humain par approches protéomiques quantitatives written by Bertrand Fabre and published by . This book was released on 2013 with total page 220 pages. Available in PDF, EPUB and Kindle. Book excerpt: La plupart des fonctions cellulaires essentielles nécessitent l'action coordonnée d'un nombre important de protéines qui sont associées en complexes multi-protéiques, ces derniers étant souvent hautement dynamiques à la fois dans le temps, dans l'espace, et en abondance. Le protéasome, complexe multiprotéique ubiquitaire et présent dans tous les compartiments cellulaires, est indispensable à la survie des cellules eucaryotes car il est responsable de la dégradation de protéines modifiées et non fonctionnelles, ou de protéines impliquées dans la régulation de nombreux processus cellulaires clés. Le protéasome présente donc une grande diversité fonctionnelle, mais également structurale. Il est en effet constitué par l'association dynamique de plusieurs sous complexes, un cœur catalytique appelé protéasome 20S présent dans tous les complexes de protéasome, et quatre types de régulateurs, 19S, PA28a/ß, PA28?, et PA200. Le protéasome 20S existe lui-même sous 4 formes principales, selon l'intégration contrôlée des sous-unités catalytiques standards (ß1, ß2 et ß5), ou immunologiques (ß1i, ß2i et ß5i), et peut être présent sous forme libre dans la cellule ou en association avec un ou deux complexes régulateurs, identiques ou différents. Le niveau de connaissance de la stœchiométrie de ces complexes, de leur répartition cellulaire, de leur dynamique, et de leur rôle fonctionnel spécifique est aujourd'hui très limité. L'objectif de ce travail de thèse a été de développer des approches utilisant les techniques les plus récentes d'analyses protéomiques quantitatives basées sur la spectrométrie de masse pour étudier la diversité structurale des complexes de protéasomes. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à la répartition des complexes de protéasome dans des cellules de leucémie aigüe myéloïde (U937 et KG1a). Pour cela, nous avons optimisé un protocole de fractionnement subcellulaire de cellule réticulées au formaldéhyde, un agent chimique qui va permettre de stabiliser les interactions protéine-protéine, associé à une technique de purification de l'ensemble des complexes de protéasome endogène et à une analyse par protéomique quantitative. Nos résultats ont montré qu'au niveau subcellulaire, le protéasome est régulé via des changements d'interaction avec ses régulateurs plutôt que via des variations de la stœchiométrie en sous unités-catalytiques. Dans un second temps, nous avons cherché à déterminer l'ensemble des protéines partenaires du protéasome dans les différents compartiments des cellules U937, pour accéder à ses fonctions subcellulaires principales. Nous avons montré que le protéasome est plutôt impliqué dans les voies de signalisation intracellulaire dans le cytosol alors qu'il est plutôt associé au contrôle qualité des protéines dans le réticulum endoplasmique. Dans le noyau, le protéasome semble avoir un rôle dans la transcription et la réparation de l'ADN endommagé. Ces résultats mettent en lumière des fonctions spécialisées du protéasome dans chaque compartiment cellulaire. Dans une troisième partie, nous avons étendu l'étude des complexes de protéasome à 8 lignées cellulaires d'origines différentes et avons pu montrer que les compositions en sous-unités catalytiques et en régulateurs étaient très variables en fonction du type cellulaire. Nous avons également développé une méthode d'étude de profil d'abondance protéique qui nous a permis de mettre en évidence des associations spécifiques et tout à fait originales de certains sous-complexes de protéasome, avec des régulateurs particuliers. L'une d'entre elles, l'interaction préférentielle entre l'immunoprotéasome et le régulateur PA28aß a pu être confirmée par d'autres approches biochimiques. Nos travaux, basés sur le développement d'outils biochimiques et de stratégies de protéomique quantitative innovants, ont donc permis de mieux comprendre la diversité, la stœchiométrie, et la dynamique des complexes de protéasome. Les méthodes développées pourront être appliquées à l'étude d'autres complexes protéiques d'intérêt.
